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细胞色素P450亚酶1A1活性荧光定量检测试剂盒操作流程
点击次数:76 发布时间:2019-11-05

18017.1 v.A

 

细胞色素P450亚酶1A1活性荧光定量检测试剂盒产品说明书

 

主要用途

 

细胞色素P450亚酶1A1活性荧光定量检测试剂是一种旨在通过乙氧基异吩噁唑脱乙基酶反应系统中乙氧基异吩噁唑转化为羟基异吩噁唑酮后荧光峰值的变化即采用荧光法来测定样品中酶活性而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的其适用于各种细胞或组织裂解萃取液样品(动物、人体)或纯化微粒体样品细胞色素P450亚酶1A1的总活性检测。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定。

 

技术背景

 

细胞色素P450亚酶1A1,简称为CYP1A1,又称芳香族碳氢化合物加羟基酶(aryl hydrocarbon hydrorylase;AHH)是肝细胞微粒体复合功能氧化酶系统的成员之一。CYP1A1由三个亚型:M1、M2、M3。其作用在于体内外源化合物(xenobiotics),包括药物、致癌剂、化学污染物的氧化代谢,即单加氧化作用(monooxygenation)和羟化作用(hydroxylation)。芳香族碳氢化合物诱导CYP1A1的表达。乙氧基异吩噁唑脱乙基酶(7-ethoxyresorufin O-deacylase;EROD)的活性是细胞色素P450亚酶1A1的诊断标记,其基于EROD选择性催化细胞色素P450亚酶1A1的活性。乙氧基异吩噁唑(7-ethoxyresorufin)在乙氧基异吩噁唑脱乙基酶的催化下,转化为羟基异吩噁唑酮(resorufin)后荧光峰值的变化(激发波长530nm,散发波长590nm,来定量测定细胞色素P450亚酶1A1的活性。乙氧基异吩噁唑脱乙基酶反应系统为:

          EROD

7-ethoxyresorufin  +  NADPH             resorufin  +  NADP+

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产品内容

 

缓冲液(Reagent A) 25毫升

反应液(Reagent B) 2.5毫升

底物液(Reagent C)     500微升

标准液(Reagent D)      50微升

产品说明书      1份

 

保存方式

 

保存在-20冰箱里,底物液(Reagent C)和标准液(Reagent D)避免光照,有效保证6

 

用户自备

 

1.5毫升离心管:用于标准样品配制的容器

恒温水槽:用于孵育反应

比色皿或黑色96孔板:用于荧光分析的容器

荧光分光光度仪或荧光酶标仪:用于荧光分析

实验步骤

 

实验开始前,将-20℃冰箱里的试剂置入冰槽里融化。然后进行下列操作。

 

  • 测定准备

 

  • 准备好待测样品(例如细胞裂解萃取液或微粒体样品等),置于冰槽里
  • 设定好荧光分光光度仪(温度为37℃):激发波长530nm,散发波长590nm增益倍数100 
  • 准备好51.5毫升离心管,标记为15号管
  • 加入180微升缓冲液(Reagent A1号管
  • 分别加入100微升缓冲液(Reagent A25号管
  • 移取20微升标准液(Reagent D1号管,混匀
  • 小心移取100微升1号管稀释的标准液(Reagent D2号管,混匀
  • 小心移取100微升2号管稀释的标准液(Reagent D3号管,混匀
  • 小心移取100微升3号管稀释的标准液(Reagent D4号管,混匀
  • 15号管放进冰槽里备用,避免光照;标准管浓度见下表

 

管号

缓冲液(Reagent A

标准液(Reagent D

标准羟基异吩噁唑酮浓度

1

180微升

20微升

200纳摩尔/升

2

100微升

100微升1号管

100纳摩尔/升

3

100微升

100微升2号管

50纳摩尔/升

4

100微升

100微升3号管

25纳摩尔/升

5

100微升

0

0

 

  • 标准曲线测定

 

  • 移取780微升缓冲液(Reagent A到新的比色皿
  • 加入100微升反应液(Reagent B
  • 加入20微升底物液(Reagent C
  • 加入100微升上述配制的标准液
  • 上下倾倒数次,混匀
  • 37℃温度下孵育10分钟
  • 即刻放进荧光分光光度仪检测:获得相对荧光单位(Relative Fluorescence Unit;RFU)
  • 重复实验步骤17四次
  • 构建标准曲线:纵座标(Y轴)为相对荧光单位(RFU);横座标(X轴)为标准羟基异吩噁唑酮浓度(纳摩尔/升

 

  • 样品测定

 

  • 移取780微升缓冲液(Reagent A到新的比色皿
  • 加入100微升反应液(Reagent B
  • 加入20微升底物液(Reagent C
  • 加入100微升待测样品(20微克微粒体蛋白或100微克细胞裂解萃取液蛋白)(注意:样品须清澈
  • 上下倾倒数次,混匀
  • 37℃温度下孵育10分钟
  • 即刻放进荧光分光光度仪检测:获得样品相对荧光单位(Relative Fluorescence Unit;RFU)
  • 根据标准曲线获得样品对应羟基异吩噁唑酮浓度(纳摩尔/升

 

  • 计算样品实际活性

 

[根据标准曲线获得样品对应羟基异吩噁唑酮浓度(纳摩尔/升X样品稀释倍数]÷ 10(分钟)摩尔/毫升/分钟÷(样品蛋白浓度)毫克/毫升=摩尔/毫克/分钟

 

  • 荧光酶标测定

 

  • 黑色96孔板上做好相应标记:标准样品和待测样品
  • 分别移取195微升缓冲液(Reagent A到相应孔
  • 分别加入25微升反应液(Reagent B
  • 分别加入5微升底物液(Reagent C
  • 分别加入25微升上述配制的标准液或待测样品(20微克微粒体蛋白或100微克细胞裂解萃取液蛋白)(注意:样品须清澈
  • 轻轻摇动黑色96孔板
  • 在37℃温度下孵育10分钟
  • 即刻放进荧光酶标仪检测:获得相对荧光单位
  • 构建标准曲线:纵座标(Y轴)为相对荧光单位;横座标(X轴)为标准羟基异吩噁唑酮浓度(纳摩尔)
  • 根据标准曲线获得样品对应羟基异吩噁唑酮浓度(纳摩尔/升
  • 样品实际活性计算:

 

根据标准曲线获得样品对应羟基异吩噁唑酮浓度(纳摩尔/升X样品稀释倍数]÷ 10(分钟)摩尔/毫升/分钟÷(样品蛋白浓度)毫克/毫升=摩尔/毫克/分钟

 

注意事项

 

  • 本产品为25次(比色皿)或85次(黑色96孔板)操作,包括标准液
  • 操作时,须戴手套
  • 系统操作过程中,标准液测定只需1
  • 样品须澄清,至关重要(本公司提供细胞可溶性总蛋白质制备试剂盒30002.1)
  • 荧光检测易受到蛋白的干扰,例如牛血清白蛋白(bovine serum albumin;BSA)会与羟基异吩噁唑酮(resorufin结合,导致荧光读数的降低
  • 如果样品读数低于背景读数明显,建议使用失活的样品作为样品背景对照,以及标准样品测定
  • 孵育反应完成后即刻进行荧光测定
  • 如果酶活性过低,可以增加反应时间至30分钟
  • 荧光测定后,比色皿须清洗彻底
  • 如果检测血液样品,建议使用体外非细胞系统细胞色素P450亚酶1A1活性荧光定量检测试剂盒——18017.2
  • 建议待测样本为微粒体,其蛋白浓度为20微克/100微升;待测样本为细胞裂解悬液,其蛋白浓度为100至200微克/100微升(本公司提供  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒30030.1)
  • 如果待测样品浓度过高或过低,可以调整样品浓度
  • 用户可以使用CYP1A1选择性抑制剂α-萘黄酮α-Naphthoflavone)作为阴性对照或抑制剂对照
  • 通常人体细胞微粒体细胞色素P450亚酶1A1活性浓度为:0.25±0.1皮摩尔/分钟/毫克蛋白
  • 细胞色素P450亚酶1A1单位活性定义为:在37℃,pH 7.5条件下,每分钟内能够转化1摩尔乙氧基异吩噁唑羟基异吩噁唑酮所需的酶量作为一个活性单位
  • 本公司提供系列毒理学检测试剂产品

 

质量标准

 

  • 本产品经鉴定性能稳定
  • 本产品经鉴定检测敏感

 

使用承诺

 

本公司秉着信誉至上、客户满意、质量承诺的宗旨为我们的用户提供产品和服务。用户收到货后,应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定,保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题,请立即以书面形式(实验报告),并将该产品退回,经检验确系产品质量所致,本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致,本公司不承担由此造成的损失。

 

 

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