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液体样本中超氧化物歧化酶(SOD)的活性
点击次数:98 发布时间:2019-10-15

犬超氧化物歧化酶(SOD)酶联免疫分析(ELISA)
试剂盒使用说明书
本试剂仅供研究使用目的:本试剂盒用于测定犬血清,血浆及相关
液体样本中超氧化物歧化酶(SOD)的活性。
实验原理:
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中犬超氧化物歧化酶(SOD)水平。用纯化的抗- SOD
抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入超氧化物歧化酶(SOD),
再与HRP 标记的SOD 抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物
TMB 显色。TMB 在HRP 酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成终的黄色。颜
色的深浅和样品中的超氧化物歧化酶呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度(OD
值),通过标准曲线计算样品中犬超氧化物歧化酶(SOD)浓度。
试剂盒组成:
试剂盒组成48 孔配置96 孔配置保存
说明书1 份1 份
封板膜2 片(48) 2 片(96)
密封袋1 个1 个
酶标包被板1×48 1×96 2-8℃保存
标准品:180U/mL 0.5ml×1 瓶0.5ml×1 瓶2-8℃保存
标准品稀释液1.5ml×1 瓶1.5ml×1 瓶2-8℃保存
酶标试剂3 ml×1 瓶6 ml×1 瓶2-8℃保存
样品稀释液3 ml×1 瓶6 ml×1 瓶2-8℃保存
显色剂A 液3 ml×1 瓶6 ml×1 瓶2-8℃保存
显色剂B 液3 ml×1 瓶6 ml×1 瓶2-8℃保存
终止液3ml×1 瓶6ml×1 瓶2-8℃保存
浓缩洗涤液(20ml×20 倍)×1 瓶(20ml×30 倍)×1 瓶2-8℃保存
样本处理及要求:
1. 血清:室温血液自然凝固10-20 分钟,离心20 分钟左右(2000-3000 转/分)。仔细收集上
清,保存过程中如出现沉淀,应再次离心。
2. 血浆:应根据标本的要求选择EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂,混合10-20 分钟后,离心
20 分钟左右(2000-3000 转/分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应该再次
离心。
3. 尿液:用无菌管收集,离心20 分钟左右(2000-3000 转/分)。仔细收集上清,保存过程
中如有沉淀形成,应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞培养上清:检测分泌性的成份时,用无菌管收集。离心20 分钟左右(2000-3000 转/
分)。仔细收集上清。检测细胞内的成份时,用PBS(PH7.2-7.4)稀释细胞悬液,细胞
浓度达到100 万/ml 左右。通过反复冻融,以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20 分
钟左右(2000-3000 转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。
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5. 组织标本:切割标本后,称取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备
用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS(PH7.4),用手工或匀浆器
将标本匀浆充分。离心20 分钟左右(2000-3000 转/分)。仔细收集上清。分装后一份待
检测,其余冷冻备用。
6. 标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。若不能马上
进行试验,可将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融.
7. 不能检测含NaN3 的样品,因NaN3 抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。
操作步骤
1. 标准品的稀释与加样:在酶标包被板上设标准品孔10 孔,在、第二孔中分别加标
准品100μl,然后在、第二孔中加标准品稀释液50μl,混匀;然后从孔、第二
孔中各取100μl 分别加到第三孔和第四孔,再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl,
混匀;然后在第三孔和第四孔中先各取50μl 弃掉,再各取50μl 分别加到第五、第六孔
中,再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul,混匀;混匀后从第五、第六孔中各
取50μl 分别加到第七、第八孔中,再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl,混
匀后从第七、第八孔中分别取50μl 加到第九、第十孔中,再在第九第十孔分别加标准
品稀释液50μl,混匀后从第九第十孔中各取50μl 弃掉。(稀释后各孔加样量都为50μl,
浓度分别为120U/mL,80U/mL ,40U/mL,20U/mL, 10U/mL)。
2. 加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、待测样
品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl,然后再加待测样品10μl(样
品终稀释度为5 倍)。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混
匀。
3. 温育:用封板膜封板后置37℃温育30 分钟。
4. 配液:将30(48T 的20 倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水30(48T 的20 倍)倍稀释后备用。
5. 洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30 秒后弃去,如此
重复5 次,拍干。
6. 加酶:每孔加入酶标试剂50μl,空白孔除外。
7. 温育:操作同3。
8. 洗涤:操作同5。
9. 显色:每孔先加入显色剂A50μl,再加入显色剂B50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色
15 分钟.
10. 终止:每孔加终止液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。
11. 测定:以空白空调零,450nm 波长依序测量各孔的吸光度(OD 值)。测定应在加终止
液后15 分钟以内进行。
注意事项:
1. 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30 分钟后方可使用,酶标包被板开封后如未
用完,板条应装入密封袋中保存。
2. 浓洗涤液可能会有结晶析出,稀释时可在水浴中加温助溶,洗涤时不影响结果。
3. 各步加样均应使用加样器,并经常校对其准确性,以避免试验误差。一次加样时间
控制在5 分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。
4. 请每次测定的同时做标准曲线,做复孔。如标本中待测物质含量过高(样本OD 值
大于标准品孔孔的OD 值),请先用样品稀释液稀释一定倍数(n 倍)后再测定,计
算时请后乘以总稀释倍数(×n×5)。
5. 封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。
6. 底物请避光保存。
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7. 严格按照说明书的操作进行,试验结果判定必须以酶标仪读数为准.
8. 所有样品,洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9. 本试剂不同批号组分不得混用。
10. 如与英文说明书有异,以英文说明书为准。
计算:
以标准物的浓度为横坐标,OD 值为纵坐标,
在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD
值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释
倍数;或用标准物的浓度与OD 值计算出标
准曲线的直线回归方程式,将样品的OD 值
代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释
倍数,即为样品的实际浓度。
(此图仅供参考)
试剂盒性能:
1.样品线性回归与预期浓度相关系数R 值为0.92 以上。
2.批内与批间应分别小于9%和15%
检测范围:
5U/mL -150U/mL
保存条件及有效期:
1.试剂盒保存:2-8℃。
2.有效期:6 个月

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