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真菌/酵母细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶酶动力光度法定量检测试剂技巧
点击次数:122 发布时间:2019-10-14

真菌/酵母细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶酶动力光度法定量检测试剂盒产品说明书

 

主要用途

 

真菌/酵母细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)活性酶动力光度法定量检测试剂是一种旨在通过特异反应系统中氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADP还原后峰值的增高即采用光度法来测定真菌/酵母细胞裂解样品中酶活性而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的其适用于各种真菌/酵母细胞裂解悬液样品葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的总活性检测。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定。

 

技术背景

 

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Glucose-6-phosphate dehydrogenaseG6PD;EC1.1.1.49)是一种细胞浆中的酶,参与磷酸戊糖代谢通路,通过维持还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADPH)水平,提供细胞还原性能量,进而保持谷胱甘肽水平,帮助细胞,例如红细胞,防止氧化损伤。同时NADPH的产生,促进组织细胞(例如肝脏、乳腺、脂肪组织、肾上腺等)生物合成脂肪酸、类异戊二烯等。在植物中,存在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的多种异构体,位于细胞浆、质体基质(plastidic stroma)、和过氧化体。在酵母细胞中,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷将干扰硫的还原性同化作用(reductive assimilation),增强对于过氧化氢的敏感等。基于葡萄糖-6-磷酸(D-glucose-6-phosphate)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的作用下,化为6-磷酸葡萄糖酸内脂(6-phosphoglucono-δ-lactone 产物后,同时其辅酶因子氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸oxidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate;β-NADP)转化为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate;β-NADPH),通过测定吸光值的变化(340nm 波长),来定量分析葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的总活性。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶反应系统为:

 

G6PD

D-glucose-6-phosphate  +  β-NADP  →   6-phosphoglucono-δ-lactone  +  β-NADPH

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产品内容

 

裂解液(Reagent A)    10毫升

强化液(Reagent B)   2

缓冲液(Reagent C)  10毫升

反应液(Reagent D)     1.25毫升

底色液(Reagent E)     1.25毫升

阴性液(Reagent F)     1毫升

产品说明书      1份

 

 

 

 

 

保存方式

 

保存裂解液(Reagent A)、缓冲液(Reagent C)、反应液(Reagent D)和底色液(Reagent E)在-20冰箱里其余的保存在4冰箱里;反应液(Reagent D)和底色液(Reagent E)避免光照;有效保证6

 

用户自备

 

1.5毫升离心管:用于样品制备和保存的容器

15毫升锥形离心管:用于样品制备的容器

(微型)台式离心机:用于样品操作

200微升1厘米光径比色皿或96孔板:用于光度的容器

分光光度仪或酶标仪:用于光度分析

 

实验步骤

 

实验开始前,将-20℃冰箱里的试剂盒中的裂解液(Reagent A置入冰槽里融化。然后进行下列操作。

 

  • 样品准备

 

  • 准备好10毫升待测的新鲜真菌/酵母细胞(OD600=0.4至0.8,即1至2 X 107细胞/毫升)
  • 移入到预冷的15毫升锥形离心管
  • 置于冰槽里5分钟
  • 放进4台式离心机离心5分钟,速度为1000g
  • 小心抽去上清液
  • 加入250微升裂解液(Reagent A),充分混匀
  • 转移到预冷的1.5毫升离心管
  • 加入100毫克强化液(Reagent B)
  • 强力涡旋震荡15秒
  • 置于冰槽里1分钟
  • 重复实验步骤9至10五次
  • 加入250微升裂解液(Reagent A),充分混匀
  • 放进4微型台式离心机离心15分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415)
  • 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
  • 移取10微升进行蛋白定量检测(注意:建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒-30030.1
  • 即刻放进-70保存或置于冰槽里继续后续操作

 

  • 测定准备

 

  • 开启并设定好分光光度仪(温度为25℃):波长340nm,间隔60秒,读数6次(共5分钟),并置零 
  • 从-20℃冰箱里取出试剂置于冰槽里融化;底色液(Reagent E避免光照
  • 缓冲液(Reagent C在室温下均衡温度
  • 背景对照测定

 

  • 移取195微升缓冲液(Reagent C到新的比色皿
  • 加入25微升反应液(Reagent D
  • 加入25微升底色液(Reagent E
  • 上下倾倒数次,混匀
  • 25℃温度下孵育3分钟
  • (选择步骤)取出比色皿
  • 加入5微升阴性液(Reagent F
  • 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
  • 即刻放进分光光度仪检测,此为背景空对照(5分钟读数-0分钟读数)

 

  • 样品测定

 

  • 移取195微升缓冲液(Reagent C到新的比色皿
  • 加入25微升反应液(Reagent D
  • 加入25微升底色液(Reagent E
  • 上下倾倒数次,混匀
  • 25℃温度下孵育3分钟
  • 加入5微升待测样品(20微克蛋白)(注意:样品须清澈
  • 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
  • 即刻放进分光光度仪检测,此为样品读数5分钟读数-0分钟读数) 

 

五、计算样品活性

 

[(样品读数-背景读数)X 0.25体系容量;毫升)X样品稀释倍数]÷[0.005(样品容量毫升)X 6.22(毫摩尔吸光系数)X 5反应时间;分钟)]=单位/毫升÷(样品蛋白浓度)毫克/毫升=单位/毫克

 

单位=微摩尔葡萄糖-6-磷酸/分钟

 

  • 酶标仪测定

 

  • 96孔板上做好相应标记:背景对照和样品
  • 分别移取195微升缓冲液(Reagent C到96孔板
  • 分别加入25微升反应液(Reagent D
  • 分别加入25微升底色液(Reagent E
  • 轻轻摇动96孔板
  • 25℃温度下孵育3分钟
  • 分别加入5微升阴性液(Reagent F待测样品(20微克蛋白)到相应孔(注意:样品须清澈
  • 轻轻摇动96孔板
  • 即刻放进酶标仪检测:5分钟读数和0分钟读数
  • 活性计算

 

[(样品读数-背景读数)X样品稀释倍数X 0.25体系容量;毫升)]÷[0.005(样品容量毫升)X 6.22(毫摩尔吸光系数)X 0.6光径距离;厘米)X 5反应时间;分钟)]=单位/毫升÷(样品蛋白浓度)毫克/毫升=单位/毫克 

 

单位=微摩尔葡萄糖-6-磷酸/分钟

 

注意事项

 

  • 本产品为50次操作,包括背景对照
  • 操作时,须戴手套
  • 强化液(Reagent B)为固体状,移取方法为:使用0.5毫升PCR管的盖子内圈盛满;或秤重0.1克
  • 系统操作过程中,背景测定只需1
  • 建议使用比色皿测定
  • 样品须澄清,至关重要 
  • 加样后3秒内光度测定
  • 测定值由低到高变化;测定可持续5分钟
  • 光度测定后,比色皿须清洗彻底
  • 样本测定5分钟读数高于0分钟读数表明具有酶活性
  • 建议待测样本蛋白浓度为20微克/5微升;如果样本酶活性过低或过高,则可以增加或降低样本量(本公司提供  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒-30030.1)
  • 如果待测样品浓度过高或过低,可以调整样品浓度
  • 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶单位活性定义为:在25℃,pH 7.4条件下,每分钟内能够转化1微摩尔葡萄糖糖-6-磷酸6-磷酸葡萄糖酸内脂所需的酶量作为一个活性单位
  • 本公司提供系列医学生化经典分析试剂产品

 

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