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植物磷脂酶Dα活性酶连续循环比色法定量检测试剂盒
点击次数:101 发布时间:2019-09-25

植物磷脂酶Dα活性酶连续循环比色法定量检测试剂盒

产品说明书

主要用途

 

植物磷脂酶Dα(Phospholipase Dα)活性酶连续循环比色法定量检测试剂是一种旨在通过磷脂酶Dα胆碱激酶、丙酮酸激酶乳酸脱氢酶的酶连续反应系统中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH)氧化后峰值的降低即采用比色法来测定植物组织裂解样品中酶活性而经典的技术方法。该技经过精心研制、成功实验证明的其适合于各种植物组织,包括种子(seed)、叶片(leaf)、根(root)、胚胎叶(cotyledon)、上胚轴(epicotyl)等裂解萃取样品Dα的活性检测。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定。

 

技术背景

 

磷脂酶(phospholipase),是一种脂质水解酶,催化磷脂的水解,产生脂肪酸和其它亲脂产物,参与磷脂代谢。磷脂酶家属有四种类型亚酶,包括A、B、C和D。磷脂酶Aphospholipase A;PLA)主要水解磷脂sn-1(磷脂酶A1催化)和sn-2(磷脂酶A2催化)位置上的乙酰基;磷脂酶B(phospholipase B;PLB)同时水解磷脂的sn-1和sn-2位置上的乙酰基,又称为溶血磷脂酶(lysophospholipase);磷脂酶C(phospholipase C;PLC)在磷酸基前水解,释放二酰基甘油(diacylglycerol;DAG)和第二信使分子三磷酸肌醇(inositol triphosphate);磷脂酶D(phospholipase D;PLD;EC3.1.4.4)在磷酸基后水解,释放磷脂酸(phosphatidic acid)。植物磷脂酶D,属于异源性酶(heterogeneous enzyme)家属成员,与哺乳动物磷脂酶D不同,有4个异构体:αβγδPLDα是磷脂酰肌醇4,5二磷酸(phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphatePIP2-非依赖性的常见的植物PLD酶,而PLDβ和PLDγ是磷酸磷脂酰肌醇辅因子(polyphosphoinositide cofactor)依赖性PLDγ在氨基酸序列同源性和生化特性上类似于PLDβPLDδ为膜相关性,游离油酸(oleic acid)可以激活。PLDα通过催化特异性磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine;PC)上磷酸二酯键(phosphodiester)的水解,产生磷脂酸和胆碱(choline),磷脂酸作为信号分子,进一步水解为二酰基甘油,与跨膜信号功能、亚细胞结构质膜的降解和重构等有关。同时通过转移磷脂基团到原生醇类的羟基上的磷脂转移活性(transphosphatidylation)。PLDα异常将导致细胞膜损害、细胞功能缺失、衰老等密切相关基于底物磷脂酰胆碱,在磷脂酶Dα的作用下,水解产生为磷脂酸和胆碱后,通过胆碱激酶choline kinase)、 丙酮酸激酶(pyruvate kinase)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase系统,测定还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotideNADH)转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(oxidized nicotinamide adenine dinucleotideNAD)的峰值变化340nm 波长),来定量分析Dα的活性。磷脂酶Dα连续循环反应系统为:

 

PLDα 

phosphatidylcholine  +  H2O           phosphatidic acid  +  choline

 

choline kinase

choline  +  ATP   o-phosphocholine  +   ADP

 

pyruvate kinase

 ADP  +  phosphoenolpyruvate        ATP  +   pyruvate   

 

lactate dehydrogenase 

 pyruvate  +   NADH       lactate  +   NAD 

(高吸收峰) (低吸收峰)

 

产品内容

 

清理液(Reagent A)    60毫升

裂解液(Reagent B)  20毫升

缓冲液(Reagent C)   5毫升

反应液(Reagent D) 500微升

酶促液(Reagent E) 500微升

底色液(Reagent F)   500微升

阴性液(Reagent G)   500微升

产品说明书      1份

 

保存方式

 

保存清理液(Reagent A)在4冰箱里,其余的保存20冰箱里;底色液(Reagent F)避免光照;有效保证6

 

用户自备

 

1.5毫升离心管:用于样品保存和反应操作的容器

15毫升锥形离心管:用于样品制备的容器

DOUNCE匀浆器:用于组织匀化

(微型)台式离心机:用于样品操作

比色皿或96孔板:用于比色的容器

分光光度仪或酶标仪:用于比色分析

 

实验步骤

 

  • 样品准备

 

  • 准备好新鲜的植物组织(叶片、谷粒、种子等),并秤重以确定1克组织重量 
  • (选择步骤)放进预冷的15毫升锥形离心管
  • (选择步骤)加入3毫升清理液(Reagent A清洗1
  • 即刻用刀片切碎组织
  • 放进一个预冷的15毫升锥形离心管
  • 加入预冷的1毫升裂解液(Reagent B)
  • 涡旋震荡5秒,充分混匀
  • 即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器,在冰槽里用匀浆棒匀化组织(约80下)
  • 将所有组织匀浆物移入1.5毫升离心管,放进4微型台式离心机离心10分钟,速度5000g(或7500RPM,例如eppendorf 5415)
  • 小心移出上清液(注意:不要触碰沉淀物)到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管
  • (选择步骤)如果上清液含有肉眼可见的残渣,重复离心5分钟一次,速度5000g(或7500RPM,例如eppendorf 5415)
  • 即刻移入到1.5毫升离心管
  • 移取10微升进行蛋白定量检测(注意:建议使用 BCA蛋白质浓度定量试剂盒-30031.1
  • 放进-70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用

 

  • 测定准备

 

  • 开启并设定好分光光度仪或酶标仪(温度为30℃):波长340nm,并置零 
  • 从-20℃冰箱里取出试剂置于冰槽里融化;底色液(Reagent F避免光照
  • 缓冲液(Reagent C室温下均衡温度

 

  • 背景对照测定

 

  • 移取170微升缓冲液(Reagent C到新的1.5毫升离心管
  • 加入25微升反应液(Reagent D
  • 加入10微升阴性液(Reagent G
  • 涡旋震荡5秒
  • 30℃温度下孵育10分钟,期间涡旋震荡3次,每次5秒
  • 煮沸5分钟
  • 室温下静置15分钟冷却
  • 转移到250微升比色皿或96孔板
  • 加入25微升酶促液(Reagent E
  • 加入20微升底色液(Reagent F
  • 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
  • 即刻放进分光光度仪或酶标仪检测,此为0分钟读数
  • 取出比色皿
  • 室温下孵育20分钟
  • 即刻放进分光光度仪或酶标仪检测,此为20分钟读数
  • 背景空对照读数=0分钟读数-20分钟读数

 

  • 样品活性测定

 

  • 移取170微升缓冲液(Reagent C到新的1.5毫升离心管
  • 加入25微升反应液(Reagent D
  • 加入10微升待测样品(100微克蛋白)(注意:样品须清澈
  • 涡旋震荡5秒
  • 30℃温度下孵育10分钟,期间涡旋震荡3次,每次5秒
  • 煮沸5分钟
  • 室温下静置15分钟冷却
  • 转移到250微升比色皿或96孔板
  • 加入25微升酶促液(Reagent E
  • 加入20微升底色液(Reagent F
  • 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
  • 即刻放进分光光度仪或酶标仪检测,此为0分钟读数
  • 取出比色皿
  • 室温下孵育20分钟
  • 即刻放进分光光度仪或酶标仪检测,此为20分钟读数
  • 样品总活性读数=0分钟读数-20分钟读数

 

  • 计算样品活性

 

比色皿计算

 

[(样品读数-背景读数)X 0.25体系容量;毫升)X样品稀释倍数]÷[0.01(样品容量毫升)X 6.22(毫摩尔吸光系数)X 10反应时间;分钟)]=单位/毫升÷(样品蛋白浓度)毫克/毫升=单位/毫克

 

单位=微摩尔PC/分钟

 

96孔板计算

 

[(样品读数-背景读数)X 0.25体系容量;毫升)X样品稀释倍数]÷[0.01(样品容量毫升)X 6.22(毫摩尔吸光系数)X 0.6 (光径距离;厘米)X 10反应时间;分钟)]=单位/毫升÷(样品蛋白浓度)毫克/毫升=单位/毫克

 

单位=微摩尔PC/分钟

 

注意事项

 

  • 本产品为20次操作,包括背景对照
  • 操作时,须戴手套
  • 系统操作过程中,背景测定只需1
  • 样品须澄清,至关重要 
  • 测定值由高到低变化
  • 比色测定后,比色皿须清洗彻底
  • 样本测定0分钟读数高于20分钟读数表明具有酶活性
  • 建议待测样本蛋白浓度为100微克/10微升;如果样本酶活性过低或过高, 则可以增加或降低样本量(本公司提供  BCA蛋白质浓度定量试剂盒-30031.1)
  • 如果待测样品浓度过高或过低,可以调整样品浓度
  • 用户可以使用磷脂酶Dα抑制N-月桂酰乙醇胺(N-lauroylethanolamine;12:0IC50=150纳摩尔)作为阴性对照或抑制剂阳性对照
  • 磷脂酶Dα单位活性定义为:在30,pH 6.5条件下,每分钟内能够水解1微摩尔磷脂酰胆碱所需的酶量作为一个活性单位
  • 本公司提供系列磷脂酶检测试剂产品

 

质量标准

 

  • 本产品经鉴定性能稳定
  • 本产品经鉴定检测敏感

 

 

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